В 1553 году мирная жизнь обители была ознаменована посещением монастыря царем и Великим князем Иоанном Васильевичем Грозным. Поводом к этому посещению послужило путешествие царя на богомолье в Кирилло-Белозерский монастырь по случаю болезни его ног. На возвратном оттуда пути по рекам Шексне и Волге, царь остановился у Толги. Игумен и братия тепло встретили Царя, отслужили молебен. Царь много со слезами молился перед чудотворной иконой Пресвятой Богородицы. И вот, в тот же час ноги у него укрепились, и он встал с кресла, на котором его носили, совершенно здоровым. Исполнившись великой радости, Царь возблагодарил Бога и Пречистую Его Матерь, одарил игумена и братию щедрой милостыней и повелел построить в обители каменный храм, который и был построен в конце XVI века при наместнике монастыря игумене Феодосии (управлял обителью с 1578 по 1602г.г.)

Игумен Феодосий – один из выдающихся игуменов монастыря. В 1602 году он был переведен Патриархом Иовом в Астраханский Троицкий монастырь, нуждавшийся тогда в опытном настоятеле, и затем был возведен в сан архиепископа Астраханского. Здесь, во время волнений, вызванных слухами о явившемся самозванце, архиепископ Феодосий неустрашимо выступил с обличением крамолы и увещевал народ не верить появившемуся Лжедмитрию, за что озлобленные мятежники разграбили дом святителя, а его сначала заключили под стражу в Троицкий монастырь, а потом отправили в Москву на усмотрение самозванца. Здесь самозванец с гневом ему сказал: «Астраханские все смуты от тебя, и людям ты говоришь и меня называешь не прямым царем, а кто же я?» На это Феодосий безбоязненно ответил: «Ведаю, что ты называешься царем, но прямое твое имя Бог весть; ибо прирожденный царевич Димитрий Иоаннович убиен в Угличе, и мощи его тамо». Лжедмитрий не имея что сказать в защиту своей личности, отослал Феодосия на патриарший двор под присмотр, без оскорбления, где он и содержался до смерти самозванца. По приказанию новоизбранного царя Василия Ивановича Шуйского, архиепископ Феодосий вместе с митрополитом Филаретом был послан в г.Углич для перенесения в Москву тела царевича Димитрия. По исполнении царского поручения, Феодосий был с честью отпущен к своей пастве, но на пути заболел и в городе Царицыне скончался 18 декабря 1607 года.

Смутные годы разразились над Толгской обителью тяжким бедствием, выразившемся в полном разорении монастыря. Еще во время осады Ярославля, отдельные шайки поляков разбрелись по окрестностям Ярославля, предавая все огню и мечу. 18 мая 1609 года достигли они и Толгского монастыря, который сделался одной из первых искупительных жертв разъяренных неудачной осадой врагов. Ворвавшись в монастырь, они подожгли ограду и кельи, монахов и послушников числом 46 человек, которые не хотели сдаваться и заперлись в каменной монастырской церкви, всех убили, образы и книги, и казну пограбили и ушли. Где в это время находилась Чудотворная икона неизвестно. Должно думать, что ее взяли с собой монастырские власти и иеромонахи, поспешившие скрыться из монастыря при нашествии врагов. Можно, впрочем полагать и то, что они были в это время в Ярославле, где в них должна была быть большая надобность для напутствия раненых и погребения убитых.
По уходе грабителей возвратившиеся монахи собрали тела убиенных и с честью похоронили в одной общей могиле на монастырском кладбище. В 1893 году над их могилой была выстроена часовня, где на мраморных плитах записаны имена всех убиенных братий.

1612 год отмечен в летописи Толгской обители древнейшим из известных крестных ходов с Чудотворной иконой в город Ярославль. Тогда Ярославль назначен был сборным пунктом для народных ополчений, собиравшихся для спасения Москвы и с ней всего Русского царства. От чрезвычайного стечения народа в городе началось моровое поветрие, от которого в мае месяце гибли тысячи людей. Князь Пожарский, духовенство и власти города решили обратиться за помощью ко всегдашней Заступнице земли Русской и послали за Ее чудотворной иконой в Толгский монастырь. Святая икона была принесена и участвовала во всеградском крестном ходе. После этого крестного хода болезнь утихла.

Ужасные стихийные бедствия – голод, моровая язва, великие пожары посещали Ярославль неоднократно, иногда с такой силой, что заставляли несчастных жителей воображать наступление кончины мира. Но и в эти дни «туги народной» всякий раз, когда над головами смятенной, бессильной перед стихией толпы, как недремлющий спасительный страж, как Божия помощь с небес появлялся Толгский Образ Царицы Небесной, народное горе затихало и часто сама стихия смиряла ярость: небеса давали воду и язва прекращалась. После поразительной благодатной помощи, полученной в тяжких бедах, постигших Ярославль в 1654-1657 годах, жители Ярославля исходатайствовали установление ежегодного крестного хода чудотворной Толгской иконы в Ярославль.

Труд восстановления монастыря после польского разгрома выпал на долю игумена Серапиона. При нем в 1620 году царем Михаилом Феодоровичем Романовым пожаловано было 40 рублей на строение церкви в честь Воздвижения Честнаго и Животворящего Креста Господня и 100 рублей на строение колокольни. Бурный расцвет обители связан с именем одного из наиболее замечательных ее настоятелей, игуменом Гордианом, управлявшим с 1673 по 1700 г. Не раз испытывал он на себе всемогущество и милость Божию: когда изнемогал от смертоносной язвы и чудесно получил здравие и крепость сил, когда потом впал в тяжелую болезнь, так что и волосы с головы его все опали, зубы повыпадали, больной истекал кровью и был уже близок к смерти. Только молитва поддерживала душевные силы изнемогающего телесно. Но Господь сподобил его еще оказать великие благодеяния обители Толгской.
Прежде всего на долю нового игумена выпала забота об окончании постройки святых монастырских ворот, которые не задолго до того времени начали строиться на средства торговцев Ярославской гостинной сотни Семена и Ивана Матвеевичей Сверчковых. Гордиану принадлежит та заслуга, что он сумел поддержать в Сверчковых расположение к Толгской обители на долгое время. Кроме устройства святых ворот и каменной Никольской церкви над ними, они пожертвовали монастырю также тысячу пудов соли и кроме того истратили на благоустройство обители 2538 рублей 15 алтын и 2 деньги – сумму по тому времени громадную. Другим большим делом игумена Гордиана была постройка величественной Введенской соборной церкви на месте древней маловместительной и уже обветшавшей. Постепенно подготовлялись материалы для будущего соборного храма, вырабатывался план, и наконец, в 1681 году Гордиан испросил у митрополита Ионы (Сысоевича) благословение разобрать малый Введенский храм и выстроить новый. Работы начались в том же 1681 году и окончились через два года. Опытный в делах строительства, он очень внимательно приготовлял план будущего храма. Лучшими для подражания были тогда соборы Ростовский и Ярославский и новостроившаяся, обнесенная папертями церковь Иоанна Предтечи в Ярославле. По плану, выработанному Гордианом, нижняя часть храма назначалась быть усыпальницей знаменитых лиц или же настоятелей обители, поэтому сам храм положено было поднять от земли более, чем на тридцать ступеней. Всю церковь назначено было, наподобие церкви Иоанна Предтечи, обнести папертями, которые давали бы возможность помещаться народу, издалека приходившему на поклонение Чудотворной иконе. Верху здания положено быть пятиглавым, как и соборы Ростовский и Ярославский. С южной стороны храма устроен придел во имя святых благоверных князей Феодора, Давида и Константина, Ярославских чудотворцев. Собор стоит посреди монастыря, как раз против святых ворот. Стены и своды храма расписаны стенным письмом греческого стиля в 1690 году искусными мастерами Ярославля и Костромы: Димитрием Семеновым-Сибиряком, Феодором Федоровым, Василием Осиповым и другими, чьи имена записаны на откосе южного нижнего окна западной паперти.